DNR ekstrahavimas ir nežinomo DNR fragmento ilgio nustatymas gelio elektroforeze

Šiuo eksperimentu buvo siekiama išgauti DNR iš skruostų ląstelių ir nustatyti nežinomo DNR fragmento ilgį, naudojant gelio elektroforezę. DNR buvo ištraukta į burną pasukant gatoradą, po to maišant su plovikliu, ananasų sultimis ir izopropilo alkoholiu, kuris sukėlė DNR. Ištraukta DNR buvo vizualizuota alkoholio ir tirpalo sąsajoje. Gelio elektroforezės metu DNR mėginiai, įskaitant dažų mišinį, nežinomą DNR ir DNR žymeklius, buvo įkelti į agarozės gelį, o fragmentai atskirti pagal dydį buvo naudojamas elektrinis laukas. DNR žymenys migruojami atstumu leido įvertinti nežinomo DNR fragmento ilgį. Rezultatai parodė, kad nežinomas DNR fragmentas buvo maždaug 2,7 kilobazės (KB) ilgio, remiantis pusiau logaritmine standartine kreive. Šis eksperimentas sėkmingai parodė DNR ekstrahavimą ir elektroforezę, suteikdama įžvalgą apie molekulinės biologijos metodus DNR analizei.

Gelio elektroforezė skiria DNR, RNR arba baltymus pagal dydį (Hames et.al, 1990). Kiekviena DNR molekulė yra dviguba spiralė, sudaryta iš dviejų papildomų nukleotidų sruogų, kurias kartu palaiko vandenilio jungtys tarp bazinių porų guanino (G) -citozino (C) ir adenino (A) -finino (T). DNR susideda iš neigiamai įkrauto fosfato stuburo sukelia migraciją link teigiamo elektrodo elektriniame lauke (Alberts ir kt., 2002). Tokie dažai kaip etidium bromidas ir „Smartglow Pre Stain“ (ne karcerogeninė alternatyva) vizualizuoja DNR, fluorescuodami UV šviesoje. Molekulės juda per gelio poras, kai greičiai yra atvirkščiai proporcingos jų ilgiui; Mažesni fragmentai migruoja greičiau (Mika ir kt., 2024 m.).

Agarozės geliai pirmiausia naudojami gelio elektroforezėje, kur elektrinis laukas naudojamas atskiroms biomolekulėms, atsižvelgiant į jų dydį ir krūvį. Gelio matrica veikia kaip molekulinis sietas, leidžiantis mažesnėms molekulėms migruoti greičiau nei didesni. Agarozės gelis yra į gelį panaši medžiaga, gauta iš agaro; iš raudonų dumblių gautas polisacharidas. Jis plačiai naudojamas molekulinėje biologijoje nukleorūgščių (DNR ir RNR) ir baltymų atskyrimui ir analizei. Gelio koncentracija daro įtaką porų dydžiui ir galios sprendimui, o migracijos atstumai gali būti nubraižyti atsižvelgiant į molekulinio ilgio logaritmą. DNR žymekliai arba kopėčios, turinčios žinomų fragmentų dydžių, leidžia tiksliai įvertinti nežinomus mėginius, palyginti migracijos atstumus. Sukuriant standartinę kreivę iš žinomų ilgio molekulių, nežinomos DNR ilgį galima apskaičiuoti, paprastai ekspresuojamos kilobazėse (KB) arba bazinėse porose (BP) (Lee ir kt., 2012).

Šio eksperimento tikslas yra išmatuoti nežinomo DNR fragmento ilgį analizuojant jo elektroforetinę migraciją, palyginti su žinomų ilgio standartiniais DNR fragmentais.

Jei nežinomas DNR fragmentas migruoja panašiai kaip standartinis žinomo ilgio DNR fragmentas, jo dydis gali būti įvertintas remiantis tuo palyginimu.

DNR ekstrahavimas iš skruosto ląstelių

DNR ekstrahavimas iš skruostų ląstelių 2 minutes sukėlė 5 ml gatorade į burną, tada tirpalą perkėlė į bandomąjį vamzdelį. Įdėjus 2 ml indų plovimo ploviklio ir sukasi vamzdelius, kad sumaišytų, į tirpalą įpilama 2 ml ananasų sulčių. Vamzdžiai buvo apversta maišyti. Toliau buvo švelniai pridedama 2 ml ledo šalto izopropilo alkoholio, o vamzdis buvo paliktas 10 minučių, kad būtų nuskaityta DNR (Mika ir kt., 2024).

Agarozės gelio paruošimas

Kitam eksperimentui agarozės geliai buvo iš anksto paruošti ir laikomi su pilkos spalvos plastiko šukomis. Ši šuka buvo kruopščiai pašalinta po to, kai gelis sukietėjo ir išsaugotos pakartotinai naudojimui. Kiekvienam studentui buvo paskirtas konkretus gelio ir elektroforezės blokas, o kamera, skirta tilpti vieną gelį. Kraunant mėginius, buvo patarta praleisti galinius šulinius, kad būtų išvengta užteršimo, ir studentai buvo skatinami įkelti du kiekvieno DNR tipo mėginius, jei norite.

Agarozės gelio elektroforezė

Kiekvienas gelis buvo pakrautas trijų tipų mėginiais: dažų mišinys, nežinoma DNR ir DNR žymeklis, kiekvienas šulinys yra maždaug 25 µl mėginio.

DNR mėginiai buvo paruošti ir užšaldyti prieš eksperimentą. Mėginiams įkelti buvo naudojamas mikropipetė su vienkartiniu pipetės antgaliu. Patarimas buvo panardintas į mėginio tirpalą, o paspaudus nykščio mygtuką, į pipetės galiuką buvo įtraukta 25 µl mėginio. Prieš kruopščiai nukreipiant pipetės galiuką į panardintą gelio šulinį, buvo pasirūpinta patikrinti ir išsiųsti bet kokius oro burbuliukus. Kiekvienas šulinys buvo užpildytas iki 25 µl talpos be perpildymo, o kiekvienam mėginiui buvo naudojamas naujas pipetės galiukas, kad būtų išvengta kryžminio užteršimo. Po pakrovimo mėginiai buteliukai buvo grąžinti į šaldiklį.

Kai DNR mėginiai buvo pakrauti, geliai buvo išdėstyti elektroforezės kameroje su artimiausiais šuliniais, esančiais arčiausiai juodo (neigiamo) elektrodo, užtikrinant, kad DNR migruotų link raudonojo (teigiamo) elektrodo. Buferio tirpalas (0,04 M Tris-Acetate EDTA, pH 8,0) buvo paruoštas ir atšaldytas iš anksto, o maždaug 200 ml šio šalto buferio buvo pridėta, kad geliai būtų visiškai uždengti, pašalinant bet kokius įstrigusius oro burbuliukus. Oranžinis dangtis buvo švelniai dedamas ant viršaus, prireikus reguliuojant.

Ant dangčio buvo pastatytas 8 cm skaidrus liniuotė, suderinta su šuliniais, kad vizualiai stebėtų DNR migraciją. Tada gelio elektroforezės blokas buvo prijungtas prie maitinimo šaltinio, o parametrai buvo sureguliuoti, kad 35 minutes veiktų 100 voltų. Laikmatis buvo nustatytas, o mygtukas Pradėti buvo paspaustas, kai visi parametrai buvo patvirtinti. DNR migracijos eiga buvo pastebėta įjungus mėlyną LED lemputę po kamera, kuri apšvietė juostas, kai jos pasitraukė iš šulinių.

Elektroforezė tęsėsi tol, kol dažų mišinys migravo į 2–3 mm atstumu nuo gelio galo. Po bėgimo įrenginys buvo išjungtas, o kabeliai buvo atjungti. Geliai buvo vizualizuoti po mėlyna LED lempute, o nuotraukos buvo padarytos naudojant juodą vaizdavimo dėžutę su oranžiniu filtru, pritvirtintu prie dangčio. Buvo pasirūpinta, kad fotoaparatas būtų suderintas su liniuote, kad būtų galima tiksliai išmatuoti juostas.

Duomenų analizė

Po vaizdavimo atstumas, perkeltas iš DNR žymeklio fragmento, buvo matuojamas MM, naudojant liniuotę. Rezultatai buvo įrašyti į paskirtą analizės lentelę. Šis atstumas buvo nubraižytas pusiau logaritmine grafiku nuo žinomų DNR žymenų dydžių, kad būtų galima įvertinti nežinomo fragmento ilgį kilobazėse (KB). Nežinomo DNR fragmento perkeltas atstumas buvo matuojamas nuo šulinio iki priekinio juostos krašto. Naudojant standartinę kreivę, atitinkama grafiko x ašies vertė, kuri yra nežinomo DNR fragmento ilgis (Mika ir kt., 2024).

Supaprastintas protokolas

DNR ekstrahavimas iš skruostų ląstelių:

1. 5 ml gatorado į burną 2 minutes.
2. Perkelkite tirpalą į bandomąjį vamzdelį.
3. Įpilkite 2 ml indų plovimo ploviklio ir sukkite, kad sumaišytumėte.
4. Įpilkite 2 ml ananasų sulčių ir apverskite vamzdelį, kad sumaišytumėte.
5. Švelniai įpilkite 2 ml ledo šalto izopropilo alkoholio.
6. Palikite vamzdelį 10 minučių, kad nusodintumėte DNR.

Agarozės gelio elektroforezė:

1. Iš anksto paruoškite agarozės gelius, laikydami juos pilkomis plastikinėmis šukomis.
2. Atidžiai nuimkite šuką, kai gelis sukietėja pakartotinai naudoti.
3. Kiekvienam studentui priskirkite konkrečius gelius ir elektroforezės blokus.
4. Praleiskite galų šulinius, kad išvengtumėte užteršimo, kai kraunant mėginius.
5. Į šulinėlius įkelkite trijų tipų mėginius: dažų mišinys, nežinoma DNR ir DNR žymeklis (25 µL per šulinį).
6. Prieš eksperimentą paruoškite ir užšaldykite DNR mėginius.
7. Norėdami įkelti mėginius į šulinius, naudokite mikropipetę su vienkartine pipetės antgaliu.
8. Įsitikinkite, kad pipetės galiuke nėra oro burbuliukų ir kiekvienam mėginiui naudokite naują galiuką.
9. Įsitikinkite, kad gelis yra pastatytas elektroforezės kameroje su šuliniais šalia juodo (neigiamo) elektrodo.
10. Iš anksto paruoškite ir atšaldykite 200 ml buferinio tirpalo (0,04 M Tris-acetato EDTA, pH 8,0).
11. Įpilkite atšaldyto buferio, kad visiškai uždengtumėte gelius, pašalindami oro burbuliukus.
12. Uždėkite oranžinį dangtį ant elektroforezės kameros, prireikus sureguliuokite.
13. Norėdami vizualiai stebėti DNR migraciją, naudokite 8 cm skaidrią liniuotę, suderintą su šuliniais.
14. 35 minutes nustatykite elektroforezės bloką į 100 voltų.
15. Stebėkite DNR migraciją naudodami mėlyną LED lemputę po kamera.
16. Tęskite elektroforezę, kol dažų mišinys bus 2–3 mm nuo gelio galo.
17. Po bėgimo išjunkite įrenginį ir atjunkite laidus.
18. Vizualizuokite gelius po mėlyna LED lempute ir fotografuokite naudodami juodą vaizdavimo dėžutę su oranžiniu filtru.
19. Susirašykite fotoaparatą su liniuote, kad būtų galima tiksliai išmatuoti juostas.

Duomenų analizė:

1. Išmatuokite atstumą, perkeltą pagal DNR žymeklio fragmentą mm, naudodami liniuotę.
2. Įrašykite matavimus lentelėje analizei.
3. Nubraižykite migracijos atstumą pusiau logaritminėje grafike pagal žinomus DNR žymeklių dydžius.
4. Naudodami standartinę kreivę, įvertinkite nežinomo DNR fragmento ilgį Kilobazėse (KB).

Rezultatai

Iš skruostų ląstelių ekstrahuota DNR buvo sėkmingai nusodinta ir tapo matoma alkoholio sąsajoje ir tirpalo tirpale mėgintuvėlyje.

Buvo išmatuotas atstumas, kurį migravo DNR žymeklio fragmentas. Atstumai buvo nubraižyti pusiau log grafike.

1 lentelė: DNR žymeklio fragmento ilgis

Buvo išmatuotas nežinomo DNR fragmento perkeltas atstumas ir fragmento ilgis buvo identifikuotas palyginus su atitinkama žymeklio verte pusiau log popieriuje.

2 lentelė: Nežinomas DNR fragmento ilgio nustatymas

Diskusija

DNR buvo išgauta iš skruostų ląstelių, pridedant įvairių tirpalų, kurie palengvino jo kritulius ir padarė jį matomą alkoholio sąsajoje ir tirpalo bandomojo vamzdžio tirpale. DNR molekulės yra per mažos, kad būtų galima vizualizuoti, ir jas galima pamatyti tik naudojant elektroninį mikroskopą, tačiau sulipimas daro jį matomą (Mika ir kt., 2024).

Gelio elektroforezės eksperimentas efektyviai parodė DNR fragmentų atskyrimą pagal dydį, naudojant agarozės gelį kaip terpę (Hames ir kt., 1990). 0,04 M Tris-acetato EDTA buferis, kai pH 8,0 palengvino neigiamai įkrautos DNR judėjimą į teigiamą elektrodą (Alberts ir kt., 2002). Sukurta standartinė kreivė iš žinomų DNR žymeklių leido mums įvertinti nežinomo fragmento ilgį maždaug 2,7 kilobazės (KB).

Skirtingas dažų mišinio atskyrimas patvirtino elektroforezės proceso vientisumą, tai rodo, kad gelis tinkamai veikia. Vizualizacija esant mėlynai šviesai leido aiškų DNR juostų vaizdą, o kruopštus išlyginimas su liniuote užtikrino tikslus atstumo matavimus.

Apskritai šis eksperimentas sėkmingai iliustruoja gelio elektroforezės principus, pabrėždamas švaraus mėginio paruošimo svarbą ir eksperimentines sąlygas patikimiems rezultatams gauti. Būsimi tyrimai galėtų ištirti skirtingas agarozės koncentracijas arba įtraukti papildomą kontrolę, kad būtų galima dar labiau sustiprinti analizę.

Nuorodos

1. Hames, BD ir Rickwood, D. (1990). Nukleorūgščių gelio elektroforezė: praktinis metodas. „Oxford University Press“.
2. Alberts B, Johnson A, Lewis J ir kt. Ląstelės molekulinė biologija. 4 -asis leidimas. Niujorkas: Garland Science; 2002 m. DNR struktūra ir funkcija. Galima rasti iš: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk26821/
3. Mika, TA, Klein, RJ, Bullerjahn, AE, Connour, RL, Swimmer, LM, White, R.
4. E., Gosses, MW, Carter, TE, Andrews, AM, Maier, JL ir Sidiq, F. (Red.). (2024). Anatomija ir fiziologija BIO 211 Laboratorijos vadovas (3 -asis leidimas). Owens bendruomenės kolegija.
5. Lee, PY, Costaibrado, J., Hsu, Cy ir Kim, YH (2012). Agarozės gelio elektroforezė DNR fragmentų atskyrimui. Vizualizuotų eksperimentų žurnalas: Jove(62), 3923. Https://doi.org/10.3791/3923