CAR-T vektoriaus plazmidės struktūriniai komponentai: išsami apžvalga

Chimerinio antigeno receptorių (CAR) T-ląstelių terapija sukėlė revoliuciją vėžio gydymui, panaudojant imuninės sistemos būdingą gebėjimą konkrečiai nukreipti ir sunaikinti piktybines ląsteles. Šis suasmenintas terapinis metodas apima genetiškai inžineriją paciento T ląstelės, skirtos išreikšti sintetinius receptorius-CARS-, kurie atpažįsta naviką specifinius antigenus, nepriklausomai nuo pagrindinio histokompatibilumo komplekso (MHC). Ši technologija yra CAR-T vektoriaus plazmidė: sintetinė DNR konstrukcija, koduojanti automobilio baltymą ir jame yra visi reikalingi reguliavimo elementai, kad būtų užtikrinta tinkama ekspresija ir funkcionalumas T ląstelėse.

Car-T vektoriaus plazmidės struktūrinių komponentų supratimas yra būtinas ne tik norint optimizuoti terapinį potenciją ir saugumą, bet ir tobulinti ląstelių imunoterapijos sritį. Šiame straipsnyje pateikiamas išsamus paties automobilio struktūros ir esminių vektorinių elementų, esančių plazmidėje, tyrinėjimas, leidžiantis efektyviai ekspresuoti automobilio išraišką, parinkti ir funkcionuoti.

1. Automobilio baltymas: modulinė struktūra ir funkcija

CAR-T terapijos šerdyje yra chimerinis antigeno receptorius-sintetinis transmembraninis baltymas, kuris suteikia T ląstelėms galimybę atpažinti specifinius su naviku susijusius antigenus ir inicijuoti citotoksinę imuninę reakciją. Automobiliai yra moduliniai, paprastai sudaryti iš trijų pagrindinių domenų:

• Ektodomenas (tarpląstelinis antigeno atpažinimas)

• Transmembraninis domenas (membranos tvirtinimas)

• Endodomenas (tarpląstelinis signalizavimas ir aktyvacija)

Kiekvienas domenas yra kruopščiai suprojektuotas, kad būtų maksimaliai padidintas T ląstelių specifiškumas, aktyvinimas ir patvarumas.

1.1 ECTODOMAINAS: Tiksliai nukreiptas į naviko antigenus

Ektodomenas išsikiša iš T ląstelių paviršiaus ir tarpininkauja antigeno atpažinimui. Jame yra trys svarbūs subkomponentai:

A) signalo peptidas

Signalo peptidas, dažnai gaunamas iš CD8α lyderio sekos, yra trumpa aminorūgščių seka N-galo seka, nukreipianti besiformuojančio automobilio baltymą į endoplazminį retikulumą. Tai palengvina tinkamą sulankstymą, glikozilinimą ir pernešimą į ląstelės paviršių. Neturėdamas veiksmingo signalo peptido, automobilio baltymai gali nepavykti pasiekti membranos, todėl terapija tampa neveiksminga.

B) antigeną jungiantis domenas (SCFV)

Ši sritis suteikia tikslinį specifiškumą. Paprastai tai yra vienos grandinės kintamasis fragmentas (SCFV), kuris yra monokloninio antikūno sunkiųjų (VH) ir šviesos (VL) grandinių kintamų sričių suliejimas, sujungtas lanksčiu peptidu. SCFV jungiasi su naviko antigenais tiesiai ant ląstelių paviršiaus, nepriklausomai nuo MHC pateikimo, leisdamas CAR-T ląstelėms apeiti naviko imuninės sistemos vengimo mechanizmus, kurie sumažina MHC molekules.

SCFV afinitetas ir specifiškumas kritiškai daro įtaką terapiniams rezultatams. Nors didelis afinitetas gali pagerinti tikslinį atpažinimą, pernelyg stiprus surišimas gali sukelti aktyvacijos sukeltą ląstelių mirtį arba toksiškumą ne tikslingai. Be to, epitopo vieta ant antigeno ir antigeno tankio ant navikinių ląstelių taip pat turi įtakos CAR-T efektyvumui. Pažymėtina, kad SCFV domenai yra linkę į agregaciją, kuri gali sukelti toninį (nuo antigeno nepriklausomą) signalą, dėl kurio atsiranda priešlaikinio T ląstelių išsekimas. Taigi inžinerinis stabilus, gerai sulankstomas SCFVS yra nuolatinė tyrimų sritis.

C) vyrių ar tarpiklio regionas

Vyrio regionas jungia SCFV prie transmembraninio domeno ir suteikia struktūrinį lankstumą, leidžiantį antigenui jungiančiam domenui pasiekti ir įtraukti tikslinius epitopus, kurie gali būti steriškai trukdomi. Tarpiklio ilgis ir sudėtis daro didelę įtaką automobilio funkcijai.

Dažniausiai naudojami tarpikliai yra vyriai nuo CD8α arba CD28 arba IgG FC sritys (pvz., IgG1 arba IgG4). IgG gaunami tarpikliai dažnai turi būti mutavę, kad būtų išvengta sąveikos su FC gama receptoriais (FcγR), esančiomis įgimose imuninėse ląstelėse, kurios gali sukelti nenumatytą imuninį atsaką ir CAR-T ląstelių klirensą. Tarpinis ilgis turi būti pritaikytas prie specifinio antigeno epitopo; Ilgesni tarpikliai palengvina prieigą prie membranos-prooksimalinių epitopų, tačiau gali padidinti toninį signalizaciją ir aktyvacijos sukeltą ląstelių žūtį, tuo tarpu trumpesni tarpikliai yra labiau tinkami membranos-distaliniams epitopams.

Be funkcinių vaidmenų, tarpinės taip pat gali tarnauti kaip antikūnų pagrindu pagamintų automobilių aptikimo ar valymo metodų epitopai, pavyzdžiui, įtraukti STREP-TAG sekas.

1.2 Transmembraninis domenas: tvirtinimas ir stabilizavimas

Transmembraninis domenas įtvirtina automobilį T ląstelių membranoje ir fiziškai jungia tarpląstelinio atpažinimo sritį su tarpląsteliniais signalizacijos moduliais. Nepaisant mažo dydžio, šis sritis daro įtaką automobilio ekspresijos lygiui, receptorių stabilumui ir signalizacijai.

Transmembraniniai domenai dažnai gaunami iš natūralių T ląstelių baltymų, tokių kaip:

• CD3ζ (CD247)

• CD4

• CD8α

• CD28

Pasirinkus transmembraninį domeną, automobilis integruoja su endogeninių T-ląstelių receptorių (TCR) kompleksais. Pavyzdžiui, CD3ζ transmembraniniai domenai gali skatinti automobilio įtraukimą į vietinius TCR kompleksus, potencialiai padidinančius aktyvaciją, bet galbūt destabilizuojančius receptorių kompleksus. CD8α ir CD28 transmembraniniai domenai linkę suteikti didesnį receptorių stabilumą ir pastovią paviršiaus ekspresiją. Be to, transmembraniniai domenai gali paveikti citokinų išsiskyrimo profilius ir toninį signalizaciją, veiksnius, glaudžiai susijusius su saugumu ir veiksmingumu.

1.3 Tarpląsteliniai signalizacijos domenai: Inicijuojanti T ląstelių aktyvaciją

Intrakeliuliarinis endodomenas antigeno atpažinimas paverčia T ląstelių aktyvacija ir citotoksiniu atsaku. Jame yra signalizacijos motyvai, sukeliantys proliferaciją, citokinų išsiskyrimą ir tikslinį ląstelių žudymą.

A) CD3ζ grandinė

CD3ζ grandinė yra pagrindinė signalizacijos sritis visuose automobilių dizainuose. Jame yra trys imunoreceptorių tirozino pagrindu pagamintos aktyvacijos motyvai (ITAMS), kurie, fosforilinant antigeno jungimosi metu, pradeda paskesnius signalizacijos kaskadas, būtinos T ląstelių aktyvacijai.

B) kostimuliaciniai domenai

Norėdami sustiprinti T ląstelių funkciją, atkaklumą ir užkirsti kelią išsekimui, automobiliuose yra vienas ar daugiau kostimuliacinių domenų prieš CD3ζ:

• CD28: Skatina greitą T ląstelių išsiplėtimą ir stiprų citokinų sekreciją, tačiau gali sukelti trumpesnį atkaklumą.

• 4-1BB (CD137): Sustiprina T ląstelių išgyvenimą ir atminties formavimąsi, prisidedant prie nuolatinio aktyvumo.

• Kiti: ICOS, CD27, OX40 ir deriniai, tokie kaip „MyD88 Plus CD40“, tiriami dėl optimizuoto signalizacijos.

Automobilių kartos klasifikuojamos atsižvelgiant į jų tarpląstelinio domeno sudėtingumą:

• Pirmosios kartos automobiliai: Vien CD3ζ.

• Antrosios kartos automobiliai: CD3ζ plius vienas kostimuliacinis domenas (čia priklauso dauguma FDA patvirtintų automobilių).

• Trečiosios kartos automobiliai: CD3ζ plius du kostimuliaciniai domenai, skirti potencialiai sustiprintai funkcijai.

2. CAR-T vektoriaus plazmidė: esminiai genetiniai elementai

Automobilio transgenas yra įterptas į plazmidės vektorių, skirtą maksimaliai padidinti ekspresijos, stabilumo ir atrankos galimybes T ląstelėse ir plazmidės sklidimo metu.

2.1 Organizatoriai: vairavimo automobilio išraiška

Efektyvus automobilio geno transkripcija priklauso nuo to, ar reikia pasirinkti promotorių, kontroliuojantį ekspresijos kasetę. Įprasti rengėjai apima:

• EF1α (1 pailgėjimo faktorius alfa): Stiprus, konstitucinis promotorius, veikiantis įvairiuose ląstelių tipuose, įskaitant T ląsteles. Tai įgalina stabilią, aukšto lygio išraišką be nutildymo.

• CMV (citomegalovirusas) nedelsiant ankstyvasis promotorius: Virusinis promotorius, turintis tvirtą ankstyvą ekspresiją, tačiau laikui bėgant gali būti nutildytas tam tikrose pirminėse ląstelėse.

• PGK (fosfogliceracer kinazės) promotorius: Silpnas, konstitucinis promotorius, naudojamas, kai norima vidutinio raiškos, siekiant sumažinti toninį signalizaciją ar toksiškumą.

Promotoriaus pasirinkimas subalansuoja pakankamo automobilio baltymų poreikį ant paviršiaus, sumažinant per didelio aktyvacijos ar išsekimo riziką.

2.2 Kozak seka: vertimo inicijavimo optimizavimas

Iškart prieš pradedantį kodoną (rugpjūčio mėn.) „Kozak Consensus“ seka (GCCGCCACC) sustiprina ribosomų surišimą ir inicijuoja efektyvų automobilio mRNR vertimą. Optimizuotos „Kozak“ sekos įtraukimas yra standartinė praktika, siekiant maksimaliai padidinti baltymų išeigą.

2.3 Poliadenilinimo signalai: mRNR stabilumo užtikrinimas

Po automobilio kodavimo sekos, poliadenilinimo (polia) signalai skatina tinkamą transkripcijos nutraukimą, mRNR stabilumą ir branduolio eksportą. Dvi dažniausiai naudojamos polia sekos yra:

• SV40 vėlyvasis polia: Iš Simian viruso 40, plačiai naudojamas žinduolių ekspresijos vektoriuose.

• BGH Polya: Galvijų augimo hormono poliadenilinimo seka, vienodai veiksminga stabilizuojant nuorašus.

Tinkamas poliadenilinimas sumažina skilimą ir padidina automobilio baltymų gamybą.

2.4 Pasirinkami žymekliai ir reporterio genai

Norėdami identifikuoti ir pasirinkti sėkmingai transfekuotas ar transdukuotas T ląsteles, plazmidėse dažnai yra tokių žymeklių kaip:

• Atsparumo antibiotikams genai (pvz., Neomicino atsparumas): Ląstelių kultūros metu leiskite pasirinkti antibiotikus.

• Fluorescenciniai baltymai (pvz., EGFP, McHerry): Įgalinkite vizualizaciją ir rūšiavimą per srauto citometriją.

• Dvigubi žymekliai: Derinant atsparumą antibiotikams ir fluorescencijai lanksčiam atrankai.

Šiuos elementus paprastai kontroliuoja atskiri promotoriai ir netrukdo automobilio ekspresijai.

2.5 Replikacijos (ORI) kilmė

Plazmidės sklidimui bakterijoms, replikacijos, tokios kaip PUC Ori yra įtraukta. Tai leidžia pakartoti aukštą kopiją E. colipalengvinant didelio masto plazmidės gamybą, reikalingą klinikinėms ir tyrimams.

2.6 Bakterijų atrankos žymeklis

Ampicilino atsparumo genas (amp^r) yra naudojamas antibiotikų atrankai bakterijų kultūroje, užtikrinant, kad plazmidę turintys bakterijos išgyventų.

3. FDA patvirtinti „Car-T“ produktai: realaus pasaulio vektorių pavyzdžiai

Keli CAR-T ląstelių terapija gavo FDA patvirtinimą, kiekvienas naudojant skirtingus, bet iš esmės panašius vektorinius dizainus.

Šie produktai parodo, kaip moduliniai automobilių ir vektorių konstrukcijos yra pritaikytos nukreipti į skirtingus antigenus ir ligas, išlaikant pagrindinę plazmidės stuburo architektūrą.

https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/research/car-cells

4. Baigiamosios pastabos: „Car-T Vector Design“ ateitis

CAR-T vektoriaus plazmidė yra kur kas daugiau nei paprasta DNR pristatymo transporto priemonė; Tai sudėtinga, smulkiai sureguliuota genetinė priemonė, būtina sėkmingai CAR-T ląstelių terapijai. Kiekvienas komponentas – nuo SCFV afiniteto ir tarpiklio ilgio, pasirinkdami transmembraninius ir signalinius domenus, skatinamojo stiprumo ir atrankos žymeklius – veikia terapinį rezultatą.

Nors pirmosios ir antros kartos automobiliai pasiekė nepaprastų klinikinių sėkmių, nuolatiniai iššūkiai apima antigeno pabėgimą, T ląstelių išsekimą ir toksiškumą. Šios problemos pabrėžia, kad reikia patobulinti vektorių dizainą, įskaitant indukuojamus rengėjus, naujus kostimuliacinius domenus, optimizuotus SCFV ir saugos jungiklius.

Kadangi CAR-T gydymas plečiasi ne tik hematologiniais piktybiniais navikais į kietų navikų ir kitų ligų, vektorinių plazmidžių reikės vystytis su pažangiais reguliavimo elementais ir smulkiai sureguliuotomis automobilių architektūromis, kad būtų galima patenkinti naujus iššūkius. Patobulintos didelio našumo atrankos ir skaičiavimo projektavimo priemonės paspartins šią plėtrą, galiausiai pagerins pacientų efektyvumą, saugumą ir prieinamumą visame pasaulyje.